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    核酸分離與純化過程中材料與方法

    點擊次數:1752  更新時間:2017-03-30

    (一)費氏弧菌發光桿菌材料與方法的選擇

    臨床常見的標本有血液、尿液、唾液、組織及培養細胞等;核酸分離與純化的方法非常多,如何恰當地收集與準備材料,選擇適宜的分離與純化方法是一個首要的問題。首先我們應當明確核酸的分離與純化并不是zui終的目的,不同的實驗研究與應用對核酸的產量、完整性、純度和濃度可能有不同的要求;至于分離與純化核酸所需的時間與成本也往往需要考慮;在不影響核酸質量的情況下,應選擇安全無毒的試劑與方案。

    (二)選擇的原則

    核酸分離與純化的方法很多,應根據具體生物材料的性質與起始量、待分離核酸的性質與用途而采取不同的方案。無論采取何種方法,都應遵循總的原則:一是保證核酸一級結構的完整性,因為完整的一級結構是核酸結構和功能研究的zui基本的要求;二是盡量排除其它分子的污染,保證核酸樣品的純度,這是本章討論的主要內容。

    (三)核酸完整性的保持

    為了保證核酸的完整性,在操作過程中,首先應盡量避免各種有害因素對核酸的破壞。影響核酸完整性的因素很多,包括物理、化學與生物學的因素,其中有些是可以避免的。如過酸或過堿,對核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作用,費氏弧菌發光桿菌在核酸的提取過程中,采用適宜的緩沖液,始終控制pH在4~10之間,就可以很好地避免其危害;另外如高溫加熱,除高溫本身對核酸分子中的化學鍵的破壞作用外,還可能因煮沸帶來液體剪切力,因此核酸提取常常在0~4℃的條件下進行。

    其次對無法避免的有害因素,應采取多種措施,盡量減輕各種有害因素對核酸的破壞。應盡量簡化分離純化的步驟,縮短提取的時間,減輕各種有害因素對核酸完整性的破壞; DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+、Ca2+等二價金屬離子,費氏弧菌發光桿菌若使用EDTA、檸檬酸鹽并在低溫條件下操作,基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的廣泛存在與不易失活的特點,決定了生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。

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